شرح صباغة البكترياب Gram stain +فيديو

صباغة البكتيريا ب Gram stain
1- حضر المواد اللازمة للصباغة
(distilled-water / Iodine / crystal violet / alcohol aceton solution / Safranin / normal saline / wire loop /slid / لهب بنزن / حوض للصباغة )
*****************
2- عمل مسحة بكتيرية باتباع ما يلي :

* أحضر slide نظبف واكتب علية اسم المريض على طرفة ، وفي منتصف slide ضع قطرة من Normal-saline
* حرق wire loop (تعقيمة) وذلك بابقائة على اللهب حتى يحمر
* بجانب لهب بنزن افتح طبق بتري المحتوي على البكتيريا المطلوب صباغتها واغرس wire loop في ال Agar بمنطقة لاتحتوي على نمو بكتيري ثم ارفعة
* قم باخذ 2-3 bacteria colony وضعهم على قطرة Normal-saline وامزجهم جيدا mix ستلاحظ تعكر Normal-saline
* احرق wire loop مرة اخرى واعدة لمكانة واترك المسحة لتجف في الهواء
* تحذير لا يجوز استخدام الحرارة لتجفيف المسحة لان ذلك يشوة الخلايا المتواجدة
* اجراء عملية التثبيت Fixation للبكتيريا بواسطة لهب بنزن (الحرارة) وذلك بتمرير slide المحتوي على المسحة فوق اللهب من4 الى 5 مرات . ان هذة العملية تساعد على تغيير طبيعة الانزيمات المحللة وذلك بمنع التحلل الذاتي للبكتيريا وكذلك الحرارة تعمل على زيادة الالتصاق الخلايا بالشريحة وعدم اجراء هذة الخطوة يعني خسارة البكتيريا المتواجدة على slide مع اول غسلة لها (وطبعا تكون المسحة البكتيرية من الاعلى وليسة من جهة اللهب)
**********************
3- عملية الصباغة :

* ضع slide المحتوي على المسحة البكتيرية المطلوب صباغتة على حوض الصباغة(وطبعا الجهة المحتوية على المسحة تكون للاعلى )
* اولا : اغمر الشريحة بCreystal violet ذو اللون البنفسجي واتركه لمدة دقيقة واحدة ثم تشطف الشريحة slide بالماء المقطر distilled water وذلك للتخلص من الصبغة الزائدة
* ثانياً: اغمر الشرحة ب iodine ذو اللون الأصفر واتركه لمدة دقيقة ثم يشطف بالماء
* ثالثا: اغمر الشريحة ب alcohol acetone solution المحضر بنسبة 1:1 ذو اللون الشفاف المستخدم لاستخلاص الصبغة decolorizer وتترك لمدة 30 ثانية ثم تشطف بالماء المقطر
* تحذير: إذا زادة المدة عن 30 ثانية سوف يؤدي ذلك لظهور نتائج متغايرة وتحديدا سؤدي ذلك لتحول g+ve إلى g-ve
* رابعاً: تغمر الشريحة ب safranin ذو اللون الاحمر الغامق التي تستخدم كصبغة بديلة counter stain وتترك لمدة دقيقة ثم تشطف بالماء المقطر
* جفف الشريحة المصبوغة باستخدام ال filter paper
* تفحص الشريحة على العدسة الزيتية قوة تكبير 100
*****************
النتائج
تصبغ باللون البنفسجي g+ve
تصبغ باللون الاحمر g-ve